AbMole科研-AZD3759通过协同阻断表皮生长因子受体和Janus激酶-1增强非小细胞肺癌的辐射效应

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: AZD3759通过协同阻断表皮生长因子受体和Janus激酶-1增强非小细胞肺癌的辐射效应。

AZD3759是在吉非替尼（Gefitinib）基础上开发的一种新型表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，已被证实可进入中枢神经系统。虽然AZD3759对非小细胞肺癌(NSCLC)具有良好的抗肿瘤作用，但该抑制剂对放疗(RA)抗肿瘤疗效的调节作用尚不明确。本研究旨在比较AZD3759和Osimertinib对非小细胞肺癌RA疗效的影响，并探讨AZD3759的潜在作用机制。我们发现，500 nM的AZD3759和8 Gy剂量的Osimertinib治疗RA处理的NSCLC细胞的存活率显著降低。AZD3759和Osimertinib联合给药分别显著增强了RA处理的NSCLC细胞的凋亡率、细胞周期阻滞和DNA损伤，以及RA处理的异种移植裸鼠的脑转移。AZD3759的疗效明显强于Osimertinib。机制上，受体酪氨酸激酶信号抗体阵列显示Janus激酶-1 (JAK1)被AZD3759特异性抑制，而不被Osimertinib抑制。AZD3759在PC-9细胞和脑转移瘤动物模型中对RA疗效的影响被JAK1的过表达显著消除。综上所述，我们的研究结果表明，AZD3759通过协同阻断EGFR和JAK1促进RA在NSCLC中的抗肿瘤作用。

AZD3759（Abmole，M5164，纯度>98%）是一种有效的，具有口服活性的，CNS-渗透性EGFR抑制剂，对EGFR (WT)，EGFR (L858R)，和 EGFR (exon 19Del)的IC50分别为0.3 nM，0.2 nM，和 0.2 nM。AZD9291(Osimertinib)（Abmole，M2424，纯度为100%）是口服不可逆的,选择性的突变体EGFR抑制剂，其对外显子19缺失的 EGFR, L858R/T790M EGFR,和 WT EGFR的IC50分别为12.92, 11.44 和493.8 nM。

Figure 1. Effects of AZD3759 and osimertinib on the sensitivity of NSCLC cells to RA are evaluated using the clonogenic assay.

为了研究AZD3759对NSCLC细胞对RA的敏感性的影响，并比较AZD3759与Osimertinib的疗效，在PC-9和H3255 NSCLC细胞中进行克隆原性试验，在连续3天每天1次使用AZD3759或Osimertinib治疗后，第一天进行irRA。如图1a,b所示，在Osimertinib组中，PC-9和H3255细胞的克隆性存活均出现剂量依赖性下降，而在AZD3759组中也观察到类似的影响(图1c,d)。然而，当RA的浓度达到400 nM或500 nM，剂量达到6或8 Gy时，与对照组相比，AZD3759组克隆成活率明显下降，说明AZD3759对NSCLC细胞RA敏感性的影响明显强于Osimertinib。

Figure 2. AZD3759 promoted the RA-induced apoptosis in NSCLC cells.

为了探索和比较AZD3759和Osimertinib对RA诱导的NSCLC细胞凋亡的影响，采用流式细胞仪测定凋亡率和细胞周期，并评价凋亡蛋白的表达水平。如图2a所示，在PC-9细胞中，与RA组相比，用AZD3759和Osimertinib共同治疗后，细胞凋亡率分别从17.43%明显升高到21.64%和20.05%。此外，与AZD3759组相比，Osimertinib组的细胞凋亡率从13.10%急剧下降到10.34%。在H3255细胞中也观察到了类似的结果，只是在AZD3759+RA组和Osimertinib+RA组之间观察到了细胞凋亡率的显著差异。这些数据表明，AZD3759明显增强了RA诱导的NSCLC细胞的凋亡，而在H3255细胞中AZD3759的作用明显强于Osimertinib的作用。我们进一步利用流式细胞术评估AZD3759和Osimertinib对RA诱导的细胞周期阻滞的影响。如图2b所示，在PC-9细胞中，与RA相比，AZD3759联合治疗后G0/G1的比例由70.55%显著提高至77.41%，而与Osimertinib联合治疗后G0/G1的比例由70.55%略微提高至71.67%。AZD3759 + RA与Osimertinib+ RA组G0/ g1比例差异有统计学意义。此外，与AZD3759相比，Osimertinib组G0/G1比例由64.37%显著降低至60.25%。在H3255细胞中也观察到类似的结果。这些数据表明，AZD3759显著增强RA诱导的NSCLC细胞周期阻滞，其作用明显强于Osimertinib。

最后，通过检测凋亡蛋白的表达，证实了AZD3759对RA诱导的细胞凋亡的影响。如图2c所示，在PC-9细胞中，与RA相比，裂解的caspase 3和裂解的PPAR被AZD3759联合给药后明显上调。与AZD3759组相比，在Osimertinib组观察到PPAR（C）的表达明显下降。在AZD3759+RA组和Osimertinib+RA组之间观察到caspase 3（C）和PPAR（C）表达水平的显著差异。在H3255细胞中，caspase 3（C）和PPAR（C）被AZD3759和Osimertinib的共同给药明显上调。与AZD3759组相比，在Osimertinib组观察到PPAR（C）的表达明显下降。

Figure 3. AZD3759 enhances the RA-induced DNA damage in NSCLC cells.

DNA损伤是RA抗肿瘤机制之一。研究了AZD3759和Osimertinib对RA诱导的DNA损伤的影响。如图3所示，在PC- 9细胞和H3255细胞中，AZD3759和Osimertinib单药治疗组很少观察到γ-H2AX免疫荧光。与RA相比，AZD3759和Osimertinib联合处理显著提高了RA的荧光强度。与AZD3759+ RA组相比，Osimertinib+ RA组荧光强度显著降低。这些数据显示，AZD3759增强了RA诱导的NSCLC细胞DNA损伤，其疗效明显高于Osimertinib。

Figure 5. AZD3759 promotes the inhibitory effect of RA on the brain metastasis by PC-9 cells in xenograft mice.

为了探讨AZD3759和Osimertinib对RA处理的异种裸鼠脑转移瘤的影响，我们分别接种PC-9-LUC细胞，然后分别用AZD3759和Osimertinib治疗。如图5a-b所示，治疗1周后各组间无显著差异。治疗后第3周，与对照组相比，RA组、AZD3759组和Osimertinib组的平均信号显著降低。与RA组相比，AZD3759和Osimertinib联合给药后平均信号显著降低，而AZD3759 + RA与Osimertinib+ RA组间差异显著。实验结束后处死动物，测量脑转移瘤体积。如图5c所示，RA、AZD3759和Osimertinib治疗组肿瘤体积被显著抑制。与RA相比，AZD3759或Osimertinib联合给药显著抑制肿瘤体积。与AZD3759 + RA组相比，AZD3759 +Osimertinib组肿瘤体积明显增大。这些数据表明，AZD3759增强了RA对PC-9细胞脑转移的抑制作用，且该作用明显强于Osimertinib。

Figure 6. JAK1 overexpression abolishes effects of AZD3759 on clone formation and DNA damage in RA-treated PC-9 cells.

为了探索AZD3759抗肿瘤疗效高于Osimertinib的机制基础，我们进行了RTK信号抗体阵列分析。如图6a所示，与RA相比，AZD3759和Osimertinib均下调了EGFR。但JAK1表达降低仅在AZD3759+RA组中可见，而在Osimertinib+RA组中未见。我们怀疑JAK1的抑制作用可能是AZD3759较Osimertinib抗肿瘤活性增强的原因。因此，我们建立了JAK1过表达的PC-9细胞，并通过Western blotting验证(图6b)。克隆实验(图6c)显示，与对照相比，JAK1过表达的PC-9细胞在所有浓度的AZD3759下存活分数均显著升高。如图6d所示，与RA相比，AZD3759共同给药后，每个细胞的γ-H2AX聚焦数显著增加，而过表达JAK1则显著减少γ-H2AX聚焦数。

Figure 7. JAK1 overexpression abolishes effects of AZD3759 on the brain metastasis by PC-9 cells in RA-treated nude mice.

进一步进行机制验证实验。如图7所示，治疗3周后，与RA相比，AZD3759联合给药显著抑制了平均信号和肿瘤体积，而JAK1过表达显著逆转了平均信号和肿瘤体积。以上结果表明，AZD3759对RA抗转移的促进作用与抑制JAK1密切相关。

鸣谢：Ruing Zhao, et al. Bioengineered. 2022 Jan;13(1):331-344.