AbMole科研-活性氧反应性纳米载体软骨靶向治疗骨关节炎

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: 活性氧反应性纳米载体软骨靶向治疗骨关节炎。

靶向软骨是治疗骨关节炎的一种很有前途的策略，各种载体被开发来辅助治疗药物进入软骨。然而，潜在的生物机制和生物活性仍然过于简化。受骨关节炎发病机制中的氧化应激的启发，我们首次证实了合成的小分子化合物Oltipraz（OL)对IL-1β处理的软骨细胞的抗氧化能力。然后，用甲氧基聚乙二醇硫代酮修饰介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)，构建了一种具有活性氧响应功能的纳米载体。体外生物分子实验结果显示，与单用OL相比，MSN-OL可显著激活Nrf2/HO-1信号通路，具有更好的ROS清除能力和更强的抗凋亡能力，保护软骨细胞线粒体膜电位。进一步的生物信息学分析显示，MSN-OL抑制与细胞外基质组织、细胞凋亡和细胞对氧化应激反应相关的基因簇。动物实验进一步证实了MSN-OL通过上调Nrf2/HO-1信号通路的表达，具有良好的软骨保护能力，且无明显毒性。综上所述，本研究提供了一种通过ROS响应调节治疗药物进入软骨细胞的传递系统，并证实了这一创新策略的确切生物学机制。

Oltipraz（Abmole，M5834，纯度>99%）是一种有效的 Nrf2 激活剂，也是一种有效的II期解毒酶诱导剂，显著作用于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

Fig. 1 Preparation and characterization of MSN-OL.

mPEG-TK-的合成过程如图1A所示，1H-NMR谱结果证实了成功的合成过程。聚合物上质子的化学位移可以通过数字来确定。接下来，MSN-OL合成的路线如图1B所示。MSN在水溶液中呈白色，MSN-NC为浅蓝色，MSN-OL为深蓝色。TEM和SEM成像显示，裸露的MSN和MSN-OL分布均匀，尺寸均匀，呈球形(图1C)。zeta电位测定结果表明，MSN和MSN-OL分别具有22 mV和18 mV的zeta电位(图1D)，表明表面带有强正电荷。DLS结果显示，MSN和MSN-OL的平均直径分别为138 nm和135 nm，这表明在OL加载的情况下，经TKmPEG修饰后，纳米颗粒的平均尺寸没有明显变化(图1E)。基于高效液相色谱(HPLC)的分析结果显示，载药效率(LE)约为3.55%，包封效率(EE%)约为11.05%(图1F)。然后评价了MSN-OL的体外释放特性。PBS孵育6、12、24、48、72 h时，MSN-OL的OL释放率分别为9.1%、16.8%、23.1%、25.6%、27.8%，而在含0.1% H2O2的PBS孵育6、12、24、48、72 h时，MSN-OL的OL释放率分别提高到22.7%、51.6%、65.2%、76.1%、85.2%，在含1% H2O2的PBS孵育6、12、24、48、72 h时，MSN-OL的OL释放率进一步提高到40.9%、61.4%、69.9%、79.1%、84.9%(图1F)。在含0.1% H2O2的PBS中，OL最初在12 h内释放，随后持续释放，72 h累积释放量约为80%。OL的释放速率在PBS中未表现出明显的相对药物释放爆发，提示氧化还原环境促进了MSN-OL的OL释放。

Fig. 2 Antioxidant and anti-apoptotic efects of MSN-OL in vitro.

纳米颗粒明显存在于细胞内，显示了软骨细胞在IL-1β存在或不存在的情况下积极吸收纳米颗粒的能力(图2A)。流式细胞术分析也用于量化纳米颗粒的细胞吸收。结果显示，IL-1处理组细胞比对照组细胞吸收了更多的纳米颗粒，尽管这种差异没有统计学意义(图2B)。进一步探讨了MSN-OL的体外抗氧化作用，以40μM OL为OL处理组，以0.27 mg/ mL为MSN-OL组，计算后与OL处理组的OL浓度相等。DCF染色结果显示，与OL处理相比，MSN-OL更有效地抑制ROS的产生(图2C, D)。此外，还对软骨细胞的凋亡进行了评估。线粒体膜电位的降低是早期凋亡事件的标志，JC-1染色结果显示，与OL相比，MSN-OL能更好地减轻软骨细胞的线粒体损伤(图2E, F)，而且annexin V-FITC/PI染色结果也表明，与OL相比，MSN-OL处理可以降低软骨细胞的凋亡率(图2K, I)。进一步的western blotting证实，在IL-1β处理的软骨细胞中，MSN-OL和OL均可降低Bax和cleaved caspase-3的表达水平，提高Bcl-2的表达水平(图2G)。与OL相比，MSN-OL降低了Bax/Bcl-2比值，切断了caspase-3水平，表明MSN-OL对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡有更强的抑制能力(图2H, J)。总体而言，与OL处理相比，MSN-OL对炎症诱导的早期和晚期细胞凋亡具有更好的细胞保护作用。

Fig. 3 Up-regulation of Nrf2-HO-1 signaling by MSN-OL.

为了进一步证实MSN-OL能增强OL的生物功能，我们建立了体外培养的软骨外植体模型。利用Illumina转录组测序技术对IL-1β+OL组和IL-1β+MSN-OL组软骨外植体的转录组进行测序。识别差异表达基因(DEGs)，并进行基因本体(GO)分析，以澄清生物学过程中的差异(图3A, B)。图3C显示了与DEGs相关的五个相关项，包括ECM的组织、细胞凋亡过程的调控、Nrf2/ARE通路、细胞对氧化应激的反应和对营养物质的反应，结果证实了MSNOL增强了OL的生物功能，并表现为Nrf2信号通路的更强激活。此外，western blotting分析进一步证实，与OL处理相比，MSN-OL增加了细胞核中Nrf2蛋白的水平(图3D, E)，并增强了IL-1β处理下软骨细胞中NQO1蛋白的表达(图3F-H)。因此，我们认为MSN-OL增强了OL的生物功能，从而发挥了更好的抗氧化损伤作用。

Fig. 4 In vivo drugs release behaviours and biotoxicity.

为了研究MSN-OL是否能将药物带入软骨，使用Perkin Elmer活体成像系统观察大鼠在第0天(立即注射单次IA后)、第3天、第7天、第14天和第21天的荧光信号(图4A、B)。荧光强度可以半定量估计MSN-OL降解情况。随着时间的推移，荧光强度下降表明MSN-OL逐渐降解和清除(图4D)。关节注射后21天内可观察到膝关节内荧光，提示MSN-OL可在关节内停留至少21天。此外，在注射IA后的不同时间点制备冰冻软骨切片。切片用Hoechst染色，在荧光显微镜下观察。荧光图像显示，大量的MSN-OL颗粒粘附在软骨表面，注射后逐渐进入软骨基质和细胞(图4C)。分析结果表明，MSN-OL降解在2周后达到峰值。第21天，软骨表面的MSN-OL几乎消失(图4E)。这些结果表明，MSN-OL作为药物载体，可以有效地将药物带入软骨和靶细胞，从而克服了快速从关节腔清除的缺点。分别于4周、8周和12周对苏木精和伊红染色大鼠的主要脏器(心脏、肝脏和肾脏)进行组织学分析，以评估MSN-OL的潜在毒性。未观察到明显的变性、坏死等病理改变，提示MSN-OL未导致明显的器官毒性(图4F)。

Fig. 5 Changes of animal behavior after MSN-OL treatment.

步态分析结果(图5A)显示，12周时，MSNOL改善了OA大鼠的光强、面积、占空比和摆动周期，而OL仅改善了OA大鼠的面积(图5B、C、E、G)。OA和MSN-OL组在站立周期(图5D)和摆动速度(图5F)方面无统计学差异。

Fig. 6 MSN-OL alleviated the disease progression in rat OA model.

此外，H&E和Safranine O-Fast Green染色显示，对照组髁突软骨在4周、8周和12周时表面完整光滑(图6A)。OA组软骨表面粗糙，软骨下骨重塑异常，软骨内糖胺聚糖减少。4周时OL治疗显示出一定的软骨保护作用。虽然软骨磨损，糖胺聚糖减少，但轮廓无明显变化。此外，MSN-OL组软骨表面、软骨下骨组织结构及糖胺聚糖含量均未见明显变化。在8周和12周时，OL组出现了严重的软骨磨损、软骨基质退化和软骨下骨重塑。相比之下，即使在12周时，MSN-OL组的软骨仍然几乎完整。进一步使用OARSI分级(图6C)和Mankin评分(图6D)来评估关节软骨退化的严重程度。MSN-OL组样品的OARSI评分和Mankin评分较低，提示MSN-OL对OA有较好的治疗效果。然后使用micro-CT扫描关节，进一步分析软骨下骨，并包括骨体积百分比(BV/TV)。OA和OL治疗组BV/TV显著升高，而MSN-OL显著降低BV/TV，提示MSN-OL对OA大鼠软骨下骨硬化也有保护作用(图6B, E)。

Fig. 7 Upregulation of Nrf2/HO-1 signaling pathway after MSN-OL treatment.

此外，免疫组化(IHC)分析显示，与OL治疗组相比，MSN-OL增加了OA大鼠II型胶原蛋白表达水平，提示MSN-OL更好地保护ECM不降解(图7A, D)。此外，与其他治疗组相比，MSN-OL也增强了HO-1(图7B)和NQO1(图7C)蛋白表达。值得注意的是，12周时，MSN-OL组HO-1和NQO1阳性细胞比例明显高于OL组(图7E, F)，提示MSN-OL增强了Nrf2信号通路的激活，从而促进HO-1和NQO1表达，在体内发挥更好的抗氧化作用。

鸣谢：Zengxin Jiang, et al. J Nanobiotechnology. 2022 Sep 19;20(1):419.