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福格特-小柳-原田病（Vogt-Koyanagi-Harada, VKH）是种复杂的多系统自身免疫性疾病，发病快且致盲率高，但其病因和发病机制尚不完全清楚。目前，免疫抑制治疗是VKH疾病的标准治疗方法，然而，长期使用皮质类固醇会导致严重的副作用。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）参与VKH疾病的各个阶段，主要表现为屏障功能损伤和色素沉着，在VKH的病因和治疗中起关键作用。诱导多能干细胞（iPSCs）是指通过引入特定的多能性基因，将已分化的细胞重编程为干细胞状态。越来越多的研究使用iPSC进行疾病建模，以探索疾病发病机制和发现创新药物治疗。

重庆医科大学第一附属医院Wanqian Li、Peizeng Yang、Shengping Hou等在Clinical Immunology上发表了题为“iPSC-based model of Vogt-Koyanagi-Harada disease for phenotype recapitulation and drug screening”的研究论文，作者首先对VKH全基因组关联分析进行研究，发现EGR2位点与VKH的易感性高度相关。研究人员通过提取人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），将其重编程为hiPSCs，再分化为RPE细胞，构建了既具有人RPE功能又具有供体遗传信息的hiPSC-RPE细胞，并以此作为VKH疾病细胞模型，研究VKH来源和正常来源的RPE的表型和功能特性。然后作者以EGR2为靶点，借助ChemBridge数据库中的139万种化合物，通过分子对接和高通量筛选，得到能够特异性靶向EGR2的化合物，进一步研究证实该化合物能够改善hiPSC-RPE细胞RPE的功能，为VKH疾病的治疗提供了新的策略。

为了获得hiPSCs，研究人员首先提取和富集VKH病患和健康对照者的PBMC，然后导入三个游离质粒（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL）和五种因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和MYCL）进行重编程以获得hiPSC（图1A）。之后对hiPSC进行鉴定发现其具有正常的多能性，可用于后续转化（图1B-F）。

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图1 从VKH患者和健康对照者的外周血中获得hiPSCs

为了将hiPSCs转化为hiPSC-RPE，研究人员向hiPSC培养皿中加入LDN193189和SB431542，然后加入烟酰胺和激活素A诱导RPE分化，成功诱导hiPSC分化成功能性RPE细胞（图2A）。经过免疫荧光检测发现，该细胞表达RPE65、BEST1等RPE标记基因（图2B、C），表明RPE细胞分化成功，成功构建hiPSC-RPE细胞模型。

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图2 诱导hiPSCs到hiPSC-RPE

为了研究VKH患者和健康人hiPSC-RPE细胞模型的表型和功能特征，研究人员通过RT-qPCR、Western blotting和免疫荧光进行分析。结果发现，VKH来源的RPE细胞中紧密连接蛋白减少（图3A-C）、细胞屏障功能受损（图3D）、色素颗粒减少（图3E）、吞噬能力下降（图3F）。说明VKH衍生的RPE细胞功能受损，与VKH疾病表型一致，表明构建的hiPSC-RPE可作为VKH病的疾病模型，可用于进一步的药物筛选研究。

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图3 VKH来源的hiPSC-RPE细胞功能损伤

为了探索VKH疾病的潜在有效治疗手段，研究人员利用ChemBridge数据库进行高通量虚拟筛选。首先，查询NCBI基因数据库获得EGR2蛋白序列，通过在线平台SWISS-MODEL进行同源建模，构建EGR2蛋白的三维结构（图4A）。之后进行分子对接，设置分子对接参数，分析EGR2蛋白活性口袋（对接位点）位置，筛选最佳潜在小分子结合位点。然后以该结合位点，从ChemBridge网站上选择并下载ChemBridge数据库中的139万种化合物，进行高通量虚拟筛选（HTVS），得到417000个苗头化合物（hit）。之后用SP模式从前30%的化合物中重新筛选得到200个化合物，再根据结合方式、成药性和可利用筛选得到最佳的50种化合物。最后，根据Lipinski规则选择了最后三种先导小分子化合物CQMU98（Z436179998）、CQMU20（Z440170920）和CQMU72（Z440457672）。购买三种化合物后通过前面构建的细胞模型做进一步的功能评价。

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图4 EGR2蛋白是基于虚拟结构筛选的小分子靶标

最后，为了验证筛选到的小分子化合物对RPE功能的影响，对构建的hiPSC-RPE细胞模型进行实验验证，通过RT-qPCR、Western blotting、免疫荧光、TEER检测和流式细胞术检测发现，CQMU98可以显著提高hiPSC-RPE细胞中EGR2和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，并增加RPE细胞的TEER值和吞噬FITC-葡聚糖的能力（图5）。表明CQMU98能够逆转hiPSC-RPE细胞受损表型，恢复RPE的屏障和吞噬功能。

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图5 小分子化合物有助于挽救hiPSC-RPE功能

本研究利用ChemBridge结构多样的化合物数据获得针对难治疾病的重要候选化合物，体现了ChemBridge化合物卓越的生物活性。AbMole是ChemBridge在中国唯一官方指定合作伙伴。

鸣谢：Wanqian Li, et al. Clin Immunol. 2023 Jan;246:109205.

标签: ChemBridge

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