AbMole科研-环形膜褶皱干扰肝细胞癌Hep3B细胞中生长因子诱导的PI3K-AKT通路

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: 环形膜褶皱干扰肝细胞癌Hep3B细胞中生长因子诱导的PI3K-AKT通路。

背景: 环形膜褶皱(CDRs)是生长因子(GF)在细胞背表面诱导形成的圆形膜褶。它们可以作为激活AKT蛋白激酶的信号平台。GF刺激后，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在质膜中生成磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)。PIP3在CDRs内部积累，招募AKT进入结构，并磷酸化它们(pAKT)。鉴于PI3K-AKT通路在GF信号中的重要性，CDRs可能参与了细胞生长。有趣的是，有些癌细胞系可以表达CDRs。我们假设CDRs通过调节AKT通路促进致癌。在本研究中，我们鉴定了表达CDRs的癌细胞系并研究了它们的细胞功能。方法:在6个肿瘤细胞系中检测表皮生长因子(EGF)和胰岛素对CDR的反应。用共聚焦显微镜和扫描电镜对CDRs的形态进行了表征，并对相关信号分子进行了观察。利用生化分析研究了CDRs在AKT通路中的作用。肌动蛋白抑制剂细胞松弛素D (Cyto D)和PI3K抑制剂TGX221被用于阻断CDRs。结果:GF治疗在肝癌Hep3B细胞系中诱导了CDRs，而在其他肝癌细胞系HepG2、Huh7和LO2肝细胞细胞系中没有诱导CDRs。共聚焦显微镜和western blot分析显示，PI3K-PIP3-AKT通路在CDRs处被激活，受体蛋白被招募到结构中。Cyto D和TGX221完全阻断了CDRs，部分减弱了GF诱导的pAKT。这些结果表明，CDRs调节Hep3B细胞中受体介导的PI3K-AKT通路，存在CDRs不依赖的pAKT机制。结论:我们的研究结果表明CDRs可以调节Hep3B细胞中的AKT通路。由于在其他HCC和肝细胞细胞系中未观察到CDRs，我们认为Hep3B中的CDRs可能通过异常触发AKT通路来决定细胞的癌特征。参与CDR形成的信号分子是某些类型HCC有希望的治疗靶点。

Insulin（Abmole，M9194） 中文名为胰岛素，是一种多肽激素，其调节血液中的糖（葡萄糖）水平并且由胰岛的β细胞产生。 A66（Abmole，M1819，纯度>99%）是一种有效的，特异性的p110α抑制剂，IC50为32 nM，作用于p110α比作用于其他I型PI3K亚型选择性高100倍以上。

Fig. 1 Growth factor stimulation induces CDRs in Hep3B cells.

我们测试了六种著名的癌细胞系在GF刺激后表达CDRs的能力。由于在乳腺癌SK-BR-3细胞系和胰腺癌PANC1细胞系中观察到CDRs，因此对两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231(图1A)和MCF-7(图1B)和一种胰腺细胞系BxPC-3(图1C)进行了检测。为了确定在HCC细胞系中是否观察到CDRs，使用Huh7(图1E)、HepG2(图1F)和Hep3B(图1G)。同时制备肝细胞LO2细胞系(图1D)作为对照。其中，我们发现在EGF处理后，只有Hep3B细胞从根本上表达CDRs(图1G,)。这也是在胰岛素Insulin刺激后观察到的(图1G)。定量分析表明，胰岛素诱导的CDRs小于EGF诱导的CDRs。有趣的是，尽管罕见，我们在培养条件下观察到Hep3B细胞中的CDRs(图1H)。这些结果促使我们对Hep3B细胞中的CDRs进行表征。

Fig. 2 Rab5a, cortactin, and N-WASP are localized at CDRs in Hep3B cells.

小的GTPase Rab5a被招募到CDRs上，可以作为标记物。为了确认诱导的环形膜皱褶是CDRs，我们用IF染色定位Rab5a。共聚焦显微镜清晰显示Rab5a位于EGF和胰岛素诱导的CDRs中(图2A)。Ras和Rab互作物1 (RIN1)蛋白激活Rab5a作为GF信号中的鸟苷交换因子。然而，我们在CDRs处没有观察到RIN1(图2B)，这表明Rab5a在CDRs处没有被激活，或者可能被其他途径激活。肌动蛋白聚合蛋白和N-WASP与CDRS的形成有关，我们在Hep3B细胞的CDR中观察到这些蛋白(图2C和D)。

Fig. 3 SEM images of growth factor-induced CDRs in Hep3B cells.

我们进一步通过扫描电镜分析(图3)对Hep3B细胞中的CDRs进行了表征，结果显示，从EGF刺激的细胞表面垂直激发了片椭圆体(图3A红色箭头)。该结构是圆形的，但在几个位置断开(图3A白色箭头)。与EGF刺激的CDRs相比，胰岛素诱导的层状足结构更小更薄(图3B红色箭头)，且断开部分明显(图3B白色箭头)。与使用IF染色图像获得的定量结果相似，我们确认SEM观察到的胰岛素诱导的CDRs小于EGF诱导的CDRs。

Fig. 4 Correlation between AKT phosphorylation and CDR formation in Hep3B cells after growth factor stimulation.

在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的质膜上募集AKT到CDRs对pAKT至关重要。因此，我们接下来研究了Hep3B细胞中CDRs在pAKT形成中的分子功能。生化分析表明，EGF刺激可在1 min内诱导pAKT;信号在5分钟达到峰值，然后下降30分钟(图4A和B)。ERK磷酸化(pERK)作为对照，峰值出现在刺激后5-10分钟之间。同时，成像分析显示，CDR在刺激后1 min内诱导形成，在5 min后观察到最大CDR形成，并在接下来的25 min内逐渐减少(图4C)。因此，在EGF刺激的Hep3B细胞中，pAKT和CDR形成的时间过程密切相关。在胰岛素刺激的Hep3B细胞中也观察到类似的模式(图4D-F)。值得注意的是，EGF和胰岛素在Huh7、HepG2和LO2细胞中诱导pAKT形成。然而，在这些细胞中没有观察到CDR，这表明CDR的形成是Hep3B细胞在GF信号环境下的一种独特的细胞反应。

Fig. 5 AKT is phosphorylated at CDRs in Hep3B cells.

CDRs受肌动蛋白细胞骨架动力学调控。我们利用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D (Cyto D)来确定阻塞CDR的形成是否影响pAKT的形成。Cyto D处理完全消除了EGF和胰岛素对CDR的反应(图5A和D)。生化分析表明，Cyto D处理减弱了GF诱导的pAKT，而pERK不受影响(图5B, C, E和F)。这些结果强烈表明，在Hep3B细胞中，CDR是GF诱导的pAKT所必需的。结果还表明，pAKT可以在CDRs中独立诱导，因为抑制剂阻断了大约50%的GF诱导的pAKT(图5C和F)。我们使用共聚焦显微镜来检测AKT是否在CDRs上定位和磷酸化。至于Rab5a、cortactin N-WASP(图2),我们观察到强大的一种蛋白激酶信号actin-positive环状结构(图5 G),表明AKT是位于CDRs。AKT和pAKT双染色显示AKT在CDRs位点被磷酸化(图5H)。有趣的是，这两个实验都显示AKT和pAKT在胞浆中被检测到。因此，这些结果表明，CDRs可以作为信号平台，在质膜上定位AKT磷酸化Hep3B，在细胞液中诱导pAKT的机制不依赖于CDRs。

Fig. 6 Receptor-mediated PI3K pathway at CDRs in Hep3B cells.

AKT通过其PH结构域与细胞膜上PI3K生成的PIP3相互作用被募集到质膜。据报道，SH3YL1是一种PIP3结合蛋白，定位于小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞中的CDRs。我们还观察到SH3YL1在Hep3B细胞中募集到CDRs(图6A)。为了确认Hep3B细胞CDRs上PIP3的生成，我们使用了一种著名的PIP3探针GFP-BtkPH。过表达后，细胞经EGF/胰岛素处理后固定，进行肌动蛋白染色。共聚焦显微镜显示GFP-BtkPH在GF刺激前主要定位于细胞质(图6B，箭头)，刺激后被招募到CDRs(图6B，放大图像)。PI3K是一种异源二聚体，由p110和p85组成。由于p110同源异构体α和β，有两种PI3K异构体:PI3Kα和PI3Kβ。p110α和p110β的染色显示两者都被招募到CDRs上(图6C和D)。在GF刺激后，PI3Ks被招募到受体蛋白上。我们还观察到，刺激后，EGFR和胰岛素受体位于CDRs(图6E)。这些结果表明，GF诱导的PI3K信号转导定位于Hep3B细胞中的CDRs。

Fig. 7 Dominant roles of PI3Kβ in EGF-induced CDR formation.

PI3K异构体在细胞生长中具有独特的功能。为了确定每个PI3K在CDRs依赖性PI3K- AKT通路中的作用，我们使用了p110α特异性抑制剂A66和p110β特异性抑制剂TGX221。共聚焦显微镜显示，TGX221完全阻断了EGF诱导的CDRs，而A66仅部分阻断了EGF诱导的CDRs(图7A和B)。有趣的是，生化分析显示，A66几乎完全阻断了EGF诱导的pAKT，而TGX221显著减弱了信号(图7C和D)。胰岛素也得到了类似的结果。这些结果表明，PI3Kβ在CDR的形成和抑制PI3Kβ阻断CDR依赖性(而非CDR依赖性)pAKT的形成中起着关键作用。这些结果也表明PI3Kα在pAKT的生成中起着重要作用。

鸣谢：Xiaowei Sun, et al. Cell Commun Signal. 2022 Jul 7;20(1):102.