AbMole科研-高分辨率SSiNGLe-AP方法揭示了哺乳动物DNA中基本位点的复杂基因组模式

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是：高分辨率SSiNGLe-AP方法揭示了哺乳动物DNA中基本位点的复杂基因组模式。

DNA损伤在生物学和疾病中起着关键作用，然而，不同类型的DNA损伤如何影响细胞功能还远远不清楚，这主要是因为缺乏高分辨率的方法，可以绘制它们在复杂基因组中的位置，如哺乳动物的基因组。在这里，我们介绍了SSiNGLe-AP方法的开发和验证，该方法可以用全基因组和高分辨率的方式绘制一种常见的DNA损伤类型和基本位点(AP)。我们将该方法应用于6种不同年龄的小鼠和人类癌细胞株的不同组织。结果发现AP位点在哺乳动物基因组中的非随机分布，在特定的基因组位置(包括单核苷酸热点)表现出动态富集，特别是受基因表达、年龄和组织类型的显著影响。总的来说，这些结果表明，我们才刚刚开始了解DNA损伤基因组模式的真正复杂性。

Methoxyamine HCl（Abmole，M10541，纯度>98%）是一种具有潜在佐剂活性的口服生物利用小分子抑制剂。甲氧基胺共价结合到无嘌呤/无嘧啶(AP) DNA损伤位点，抑制碱基切除修复(BER)，这可能导致DNA链断裂和细胞凋亡的增加。

Fig. 2. Validation of SSiNGLe-AP.

为了评估方法性能，制备了3个含有AP位点的细菌DNA片段，并在片段后将其插入到人类基因组DNA的背景中。为了在片段中生成AP位点(图2a)，首先，在1:125 dUTP:dTTP存在的情况下，通过PCR将尿嘧啶加入到细菌控制序列中。其次，用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理PCR产物，UDG是一种能识别DNA中的尿嘧啶碱基并将其转化为AP位点24的酶，并以阳性的尖刺蛋白为载体，这些尖刺蛋白应该包含在原序列中胸腺嘧啶存在的核苷酸位置上的AP位点。然而，UDG生成的AP位点可能不是插入序列中基本位点的唯一来源，因为AP位点也可以通过DNA11,12的自发脱嘌呤发生，这是在PCR过程中DNA的高温(94℃)暴露的帮助下发生的。因此，为了研究这种人工位点的作用，制备了含有尿嘧啶但未使用UDG处理的阴性峰值蛋白(图2a)。如图2b所示，与“−APE1”对照相比，用APE1处理的DNA所制备的文库具有明显更高的信号，这表明SSiNGLe-AP过程中的绝大多数信号应该来自于APE1的切割，由此推断AP位点。然后分析映射到峰值序列的读取的分布，以估计该方法的以下性质。

首先，来自3'OH终端的背景无法被屏蔽。如图2c所示，背景非常低(1 - 2%)，这可以从对照中峰值的3 '端信号的富集得到证明。第二，检测到真实的AP位点。正如预期的那样，在阳性突蛋白中发现的AP位点对应的核苷酸在胸腺嘧啶中富集，且富集程度随着AP位点相对检测深度的增加而增加(图2d)。第三，通过在特定胸腺嘧啶位置明显富集的刺入AP位点的峰分布来估计检测精度，且大部分信号位于T碱基1个核苷酸内(图2e)。如图2f所示，Methoxyamine和MMS处理的样品在预期方向上都一致显示出统计学上显著的趋势(p<0.05)。Methoxyamine处理导致基于APL和APF的AP位点比例分别下降17.4%和27.3% (图2f)。相反，MMS处理导致基于APL和APF的AP位点比例分别平均增加13.9%和31.6%。在HeLa细胞中，K562细胞分别为12.3%和28.3%(图2f)。

鸣谢：Ye Cai, et al. Nat Commun. 2022 Oct 5;13(1):5868.