AbMole科研-miR-15b-5p/TGFBR3轴对H2S诱导的肉鸡法氏囊坏死和炎症的调节及氧化应激在此过程中的参与

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是：miR-15b-5p/TGFBR3轴对H2S诱导的肉鸡法氏囊坏死和炎症的调节及氧化应激在此过程中的参与。

硫化氢 (H2S) 是一种空气污染物，对免疫系统有毒性作用。坏死性凋亡已被讨论为一种新的细胞死亡形式，并在炎症中起重要作用。为了研究H2S诱导的免疫损伤机制，以及microRNAs（miRNAs）在这一过程中的作用，基于高通量测序结果，我们选择了变化最显著的miR-15b-5p进行后续实验。我们通过miRDB、Targetscan和双荧光素酶进一步预测并确定了miR-15b 5p与TGFBR3在HD11中的靶向关系，发现miR-15b-5p在H2S诱导的坏死性凋亡和炎症中高表达。为了了解 miR 15b-5p/TGFBR3 轴是否可能参与坏死性凋亡和炎症过程，我们进一步揭示了 miR 15b-5p 的高表达和 TGFBR3 的敲低可诱导坏死性凋亡。 Nec-1 处理提高了细胞的存活率。值得注意的是，H2S 暴露会诱导氧化应激并激活 TGF-β 途径，这些途径共同受 miR-15b-5p/TGFBR3 轴的调节。我们目前的研究为miR-15b-5p/TGFBR3 轴调节的坏死性凋亡提供了新的视角，并揭示了免疫疾病中炎症调节的一种新形式。

z-VAD-fmk（Abmole，M3143，纯度99.47%）是一种可渗透细胞的，不可逆pan-caspase抑制剂，抑制细胞凋亡的全部特性。本研究处理细胞浓度为 30 nM。

Fig. 2. NaHS treatment induces necroptosis and inflammation in DT40 and HD11

我们分别用 200 nM 的 Nec-1（RIPK1 抑制剂）和 30 nM 的 z VAD-fmk（Caspase 抑制剂）处理 HD11 和 DT40 24 小时，发现 Nec-1 可以显著抑制 LDH 和显著减少细胞死亡次数。 Nec-1 和 z-VAD-fmk 的组合可以最大限度地保护细胞免受 NaHS 暴露诱导的细胞死亡（图 2B，C）。

分子水平检测坏死性凋亡和炎症相关基因的表达水平，发现 RIPK1 和 RIPK3 的 mRNA 和蛋白表达水平，MLKL 的磷酸化，促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β）的释放在 DT40 和 HD11 中 NaHS 处理后显著增加（图 2D-K）。然而，与 z-VAD-fmk 预处理的细胞相比，在 NaHS 暴露下，Nec-1 预处理的细胞中与坏死性凋亡和炎症相关的基因表达受到显著抑制。此外，与 Nec 1 预处理的细胞相比，Nec-1 和 z-VAD fmk 的组合预处理并没有抑制 NaHS 暴露下坏死性凋亡和炎症的发生（图 2D-K）。

Fig. 4. miR-15b-5p/TGFBR3 axis regulates necroptosis and inflammation in HD11

Fig. 5. ROS involves in miR-15b-5p/TGFBR3 axis-mediated necroptosis and inflammation

在确定 miR-15b-5p 参与 H2S 暴露诱导的坏死性凋亡和炎症并验证其靶基因 TGFBR3 后，为了探索 miR-15b-5p/TGFBR3 轴是否可以调节坏死性凋亡和炎症，我们在HD11 体外培养用于后续实验（图 4A）。LDH 释放试验的结果表明，miR-15b-5p mimic 和 siTGFBR3 均可诱导 HD11 的细胞膜破裂（图 4B）。细胞死亡的数量也显著增加（图4C）。此外，RIPK1 和 RIPK3 的 mRNA 和蛋白质表达水平、MLKL 的磷酸化以及促炎细胞因子的释放显著增加（图 5D-G）。然而，与 z-VAD fmk 预处理的细胞相比，Nec-1 预处理的细胞在 miR-15b-5p 的过表达或 TGFBR3 的敲低、细胞膜破裂程度（图 5B）和细胞死亡（图 5C 和 D）显著减少，与坏死性凋亡和炎症相关的基因的表达（图 5D-G）也被显著抑制。 z-VAD-fmk 和 Nec-1 的协同抑制并没有进一步降低细胞坏死和炎症的程度（图 5B-G）。上述发现说明 miR-15b-5p/TGFBR3 轴促进 HD11 中的坏死性凋亡和炎症。

Fig. 6. TGF-β pathway is activated by miR-15b-5p/TGFBR3 axis-mediated necroptosis and inflammation

我们在体外对其进行了验证，发现 miR-15b-5p-mimic 和 siTGFBR3 都可以激活 TGF-β 通路，并且 Nec-1 预处理的 HD11 的 TGF-β 通路在转染后被显著抑制（图 6B） , 表明 TGF-β 通路在 miR-15b-5p/TGFBR3 轴介导的坏死性凋亡过程中被激活。值得注意的是，在转染 miR-15b-5p-mimic 的 HD11 和用 z-VAD-fmk 预处理的 siTGFBR3 中，TGF-β 通路也被激活（图 6B），这可能是 miR-15b 5p/ TGFBR3轴对细胞凋亡的影响很小，TGF-β通路不受此过程的影响。

鸣谢：Chi Qianru, et al. J Hazard Mater. 2021 Mar 15;406:124682.