AbMole科研-芪参颗粒治疗急性心肌缺血的新途径P2X7R-NEK7-NLRP3炎症体的激活

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: P2X7R-NEK7-NLRP3炎症体的激活：芪参颗粒治疗急性心肌缺血的新途径。

背景：急性心肌缺血（AMI）是一种常见的心脏疾病，发病率和死亡率逐年上升。心肌组织持续的无菌性炎症浸润是诱发急性心肌缺血继发急性心肌梗塞的重要因素，NLRP3炎症体的激活是急性心肌缺血后无菌性炎症反应的重要组成部分。以往研究表明，芪参颗粒（QSG）能明显抑制缺血引起的心肌组织炎症性损伤，但其抑制NLRP3炎症体激活的效果和具体机制尚未见报道。本研究旨在探讨QSG抑制AMI后炎症的具体机制，并对可能的靶点进行验证。方法：通过结扎左前降支冠状动脉建立小鼠心肌缺血模型。用超声心动图来评估小鼠的心脏功能。用ELISA检测血浆CK-MB和cTnl以评估心肌损伤的程度。通过HE染色和IL-18、IL-1β的免疫组化来评估小鼠心肌组织炎症的程度。通过免疫荧光检测NLRP3、ASC、Caspase-1和CD86的表达；通过Western blot检测关键通路蛋白P2X7R、NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1，以及效应蛋白IL-18、IL-1β。在体外实验中，使用A TP+LPS构建RAW264.7巨噬细胞NLRP3炎症体激活模型。进行免疫荧光和Western blot分析，检测NLRP3途径激活物和效应物蛋白的表达。质粒转染的P2X7R过表达和免疫沉淀实验被用来评估QSG调节的NLRP3炎症体激活途径。结果：QSG通过抑制NLRP3炎症体的激活，挽救了小鼠的心脏功能，并进一步减少了炎症影响。在体外，QSG通过下调NLRP3炎症体关键通路蛋白的表达，抑制了LPS联合A TP诱导的RAW264.7巨噬细胞的NLRP3炎症体激活。此外，在RAW264.7巨噬细胞中抑制或过度表达P2X7R以及免疫沉淀的蛋白质相互作用进一步证实，QSG通过P2X7R-NEK7-NLRP3途径降低巨噬细胞炎症体的激活。结论：P2X7R-NEK7-NLRP3炎症体的激活是QSG治疗急性心肌缺血的一个新的治疗机制。

MCC950（Abmole，M6164，纯度>99%）是一种有效的选择性NLRP3 抑制剂，作用于BMDMs 和 HMDMs，IC50 分别为 7.5 nM 和 8.1 nM。

Figure 1 QSG improved cardiac function in mice after AMI.

我们在适应性喂养3天后，用LAD结扎法制备了小鼠的AMI模型。如（图1A）所示，口服QSG，4-7天腹腔注射NLRP3抑制剂（MCC950），随后进行心脏超声心动图，并获取相关参数。3天药物干预后，超声心动图显示，与假肢组相比，模型组的LVID; d和LVID的数值增加，而LVEF、LVFS、LV AW; d，LV AW; s，LVPW; d，LVPW的数值下降（P < 0.001），表明AMI后小鼠的左心室收缩和舒张功能受损（图1B）。QSG治疗后，LVEF和LVFS与模型组相比明显增加（P<0.001），表明QSG治疗可以有效改善AMI小鼠的心功能。阳性药物MCC950，一种NLRP3炎症体抑制剂，也被证明可以改善AMI小鼠的心脏功能（图1B）。我们进一步检查了QSG对AMI小鼠心脏损伤的影响。检测了各组的血浆CK-MB和cTnI水平（图1C）。结果显示，与假肢组相比，模型组的CK-MB和cTnl水平升高（P < 0.001），表明模型组小鼠的心肌损伤很严重。而与模型组相比，QSG和MCC950组降低了心脏损伤标志物CK-MB和cTnI的血浆水平，这表明QSG可以减轻AMI后小鼠的心肌损伤。

Figure 2 QSG attenuated myocardial tissue inflammatory injury in AMI mice.

用HE染色来评估各组AMI小鼠的心肌组织损伤。结果显示在图2A。假肢组心肌细胞完整，细胞核正常，心肌纤维排列整齐，未见炎症细胞浸润。与假肢组相比，模型组心肌细胞无序，细胞核固定，心肌纤维不清楚或消失，心肌间质有大量炎症细胞浸润。而QSG组小鼠的心肌组织显示出心肌细胞的完整性和心肌纤维排列的整齐性，心肌间质中的炎症细胞浸润程度降低。同时，MCC950也有同样的效果。此外，我们通过免疫组织化学（IHC）检测了各组心肌组织中IL-1β和IL-18的表达和分布（图2B和C）。与假肢组相比，模型组的心肌细胞中IL-1β和IL-18的表达升高了。与模型组相比，QSG和MCC950组的表达量减少。为了证实这一现象，我们用ELISA检测了各组心肌组织匀浆中的炎症因子IL-18和IL-1β的水平（图2D），结果与IHC的结果相似。至此，我们发现QSG保护心肌组织免受AMI损伤的药效与NLRP3抑制剂MCC950相同，这表明QSG保护心肌组织免受炎症损伤可能与NLRP3炎症体的抑制有关。

Figure 3 QSG inhibited NLRP3 inflamat some activation in cardiac tissue macrophages.

为了直接明确心肌组织中是否存在NLRP3炎症体的激活，采用NLRP3、ASC和Caspase-1三种抗体进行免疫荧光三联标记，分别显示红色、绿色和粉红色的荧光，DAPI染色的细胞核显示蓝色荧光（图3A）。与假肢组相比，模型组小鼠心肌组织的红、绿、粉红色荧光强度增强；而与模型组相比，QSG和MCC950组小鼠心肌组织的红、绿、粉红色荧光强度下降。这一结果表明，AMI小鼠的心肌组织中NLRP3炎症体被激活，而QSG可以抑制NLRP3炎症体的激活。NLRP3炎症体的激活诱发了AMI后的炎症反应，进一步加重了缺血区的心肌损伤。NLRP3炎症体的成分，如NLRP3、ASC和Caspase-1，主要在炎症细胞中表达，特别是巨噬细胞。因此，根据前期的研究基础，结合文献回顾，用CD86标记的促炎症巨噬细胞（红色荧光）和Caspase-1（绿色荧光）来间接代表NLRP3炎症体的激活。用免疫荧光双染法观察各组AMI小鼠心肌组织中巨噬细胞和NLRP3炎症体的激活情况（图3B）。与假肢组相比，模型组的红色和绿色荧光强度都有所增加。然而，与模型组相比，服用QSG后，心肌组织中的红色和绿色荧光强度减弱了。MCC950是NLRP3炎症体激活的特异性抑制剂，被证明可以抑制巨噬细胞中NLRP3炎症体的激活。接下来，我们通过WB检测心肌组织中与NLRP3炎症体激活相关的蛋白（图3C-I）。P2X7R和NEK7是NLRP3炎症体激活的关键因素，参与NLRP3炎症体激活的激活信号阶段。P2X7R蛋白表达的增加可以诱导NEK7与NLRP3结合，并促进NLRP3、ASC和pro-Caspase-1的组装，导致NLRP3炎症体的激活。WB结果见图3C和D。与假肢组相比，模型组P2X7R和NEK7的表达量增加（P＜0.001）；而与模型组相比，QSG和MCC950组P2X7R和NEK7的表达量降低（P＜0.001），说明QSG可以抑制P2X7R和NEK7蛋白的表达。NLRP3炎症体激活蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1和效应蛋白IL-18和IL-1β的WB结果见图3E-I。模型组中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的水平明显增加，而QSG的干预则减少了上述蛋白的表达。

Figure 4 QSG inhibited LPS combined with ATP-induced NLRP3 inflammasome activation in RAW264.7 macrophages.

根据之前的实验结合文献研究，课题组选择了10μg/mL浓度的LPS结合5mM浓度的A TP来刺激RAW264.7巨噬细胞诱导NLRP3炎症体的激活。但由于LPS和A TP的刺激时间并不明确，因此将LPS给药的干预时间点定为12 h和24 h，A TP刺激的干预时间点定为0.5 h和1 h。CCK8检测的结果见图4A。与对照组相比，用LPS（10μg/mL，24小时）结合A TP（5mM，1小时）处理的模型组的细胞活力明显下降（P < 0.001）。进一步，用免疫荧光法来验证用CCK8得到的结果，如图4B所示。WGA染色的细胞膜显示绿色荧光，Caspase-1阳性显示红色荧光，这代表NLRP3炎症体的激活。结果显示，LPS（10μg/mL，24 h）+ATP（5 mM，1 h）使Caspase-1阳性的红色荧光强度增强，表明大量的NLRP3炎症体被激活。因此，在RAW264.7巨噬细胞中成功建立了由LPS结合A TP诱导的NLRP3炎症体激活的模型，为后续实验的继续进行提供了依据。在评估QSG对NLPR3炎症体激活的调控作用之前，CCK8结果显示，QSG与RAW264.7巨噬细胞共同处理时，低于1200μg /mL的QSG是无毒的（图4C）。在成功建立了由LPS结合A TP诱导的RAW264.7巨噬细胞NLRP3炎症体激活的模型后，有必要进一步确定QSG在该模型条件下的有效浓度。QSG给药的实验方案见图4D。CCK8检测结果如图4E所示，在给予不同浓度的QSG（100、200、400、600、800、1000μg /mL）后，与模型组相比，QSG的浓度在200-1000μg /mL范围内有效，800μg /mL最有效（P < 0.001）。因此，在后来的细胞实验中，QSG的管理浓度被确定为800μg /mL。同时，我们通过检测RAW264.7巨噬细胞的NO释放，确定抑制剂MCC950对细胞的最佳浓度为10μM（P < 0.001）（图4F）。随后，在上述建立的条件下，QSG抑制RAW264.7巨噬细胞中NLRP3炎症体激活的能力得到了验证。与我们的预测一致，WB结果显示，与对照组相比，模型组中NLRP3炎症体激活途径相关蛋白P2X7R、NEK7和炎症体激活蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1以及效应蛋白IL-18和IL-1β的表达水平明显增加，而QSG和MCC950处理后，上述蛋白的表达被下调（图4H-M）。

鸣谢：Yanqin Li, et al. J Inflamm Res. 2022 Sep 13;15:5309-5326.