AbMole科研快报-聚苯乙烯纳米颗粒暴露支持ROS-NLRP3轴依赖性DNA-NET促进肝脏炎症

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是：聚苯乙烯纳米颗粒暴露支持ROS-NLRP3轴依赖性DNA-NET促进肝脏炎症。

塑料的广泛使用和纳米技术的迅速发展给我们的生活带来了便利，但同时也增加了环境负担，增加了生物体接触纳米颗粒(NPs)的风险。虽然最近的研究揭示了纳米颗粒与肝损伤之间的联系，但NP暴露诱导的肝损伤的内在机制仍有待探索。在这里，我们发现聚苯乙烯纳米颗粒(PSNP)暴露导致肝脏中局部中性粒细胞浸润和中性粒胞外陷阱(NET)形成显著增加。对PBNs和AML12细胞共培养系统的分析表明，PSNP诱导的NET的形成与活性氧(ROS)-NLRP3轴呈正相关。在AML12中抑制ROS和遗传和药理抑制NLRP3均可缓解PSNP诱导的NET形成。反过来，小鼠暴露于体内分解NET的脱氧核糖核酸酶I (DNase I)包被的PSNPs，肝脏中的中性粒细胞浸润减少，ROS-NLRP3轴被抑制，细胞因子表达明显降低。总之，该工作揭示了PSNP暴露诱导的肝脏炎症中NET形成的机制，并强调了DNase I作为降解NET和缓解肝脏炎症的关键酶可能发挥的作用。

[Acetylcysteine]2（Abmole，M5385，纯度为100%）是ROS抑制剂，拮抗多种蛋白酶体抑制剂的活性。它还是肿瘤坏死因子TNF的抑制剂。MCC950（Abmole，M6164，纯度>99%）是一种有效的选择性NLRP3 抑制剂，作用于BMDMs 和 HMDMs，IC50 分别为 7.5 nM 和 8.1 nM。

Fig. 4. PSNPs exposure induce ROS production in livers, AML12, and PBNs.

本研究通过检测肝脏匀浆中抗氧化酶活性和氧化产物含量，分析PSNP暴露是否能激活肝脏中的氧化应激。与以往研究类似，在PSNPs和/或LPS暴露过程中，与对照组相比，肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著降低，丙二醛(MDA)含量显著升高，且在PSNPs和LPS联合处理下其变化程度更为明显(图4A)。2,7 -二氯二氢荧光素二乙酸(DCFH-DA)染色显示，暴露于体内和体外PSNPs和/或LPS的PBNs中ROS的生成升高(图4B-C)。此外，还检测了PSNPs和/或LPS处理的PBNs和AML12细胞中的ROS水平。正如预期的那样，PSNP暴露促进了ROS的产生，这与LPS刺激AML12细胞所引起的效果相当，表明PSNP诱导ROS。

为了探索ROS在PSNPs诱导的NET形成中的作用，我们建立了两个PBNs和AML12共培养体系。在经过PSNPs处理的AML12中，与PBNs共培养12 h后，ROS的产生显著增加。有趣的是，在经过NAC预处理的AML12后，PSNPs再次暴露于AML12, PBNs中ROS的产生远不如NAC预处理的明显(图4D-4E)。在另一种共培养体系中，我们先提取PBNs，用PS NPs处理，然后与AML12细胞共培养12 h，也显示出显著的ROS产生。值得注意的是，在相同的共培养条件下，当DNase I-PSNPs用于处理PBNs时，ROS的产生并没有增加(图4F-G)。

Fig. 5. ROS drive NET formation in response to PSNPs exposure.

与ROS产生趋势一致，qPCR数据显示，与PBNs+DNase I-PS+AML12共培养培养基(CMs)相比，PBNs+PS+AML12共培养培养基中TNF-α和IL-6的表达明显降低(图5A-5B)。为了阐明ROS对PSNP诱导的NET形成是否至关重要，为了确定PSNP暴露的AML12细胞是否能诱导PBNs形成NETs，我们使用DNase I- PSNP暴露的AML12细胞与PBNs共培养12 h，发现NET的形成明显减少。值得注意的是，在NAC预处理的AML12细胞中，PSNP刺激并与PBNs共培养后，NET的形成也受到抑制，而DNase I- PSNP刺激的NAC预处理的AML12细胞没有形成NETs(图5C-D)。此外，qPCR数据进一步验证了在上述共培养体系中，CMs中TNF-α和IL-6的表达也发生了变化;即与AML12 +PS+PBNs的CMs相比，NAC+AML12 +PS+PBNs的CMs中TNF-α和IL-6的表达明显降低，而NAC+AML12 +DNase - I-PS+PBNs的CMs中TNF-α和IL-6的表达下降更为明显，但仍高于AML12 +PBNs对照组(图5E-F)。我们的研究结果确认了ROS在PSNP暴露诱导的NET形成中的重要作用

Fig. 6. PSNPs exposure activate NLRP3 pathway in livers and AML12

通过检测PSNP和LPS暴露肝脏中NLRP3通路相关基因的mRNA和蛋白表达，我们发现PSNPs可以在与LPS处理相当的程度上激活NLRP3信号通路，并且在PSNPs和LPS联合作用下被强烈激活(图6A-B)。与体内NLRP3的激活相似，免疫荧光染色显示，单独PSNPs或LPS处理均可激活AML12细胞的NLRP3通路，两者结合可使细胞大量表达NLRP3和Caspase-1(图6C)。DCFH-DA染色显示，PSNP刺激下的siNLRP3-AML12(图6D)产生的ROS少于PSNP刺激下的AML12(图6E)。在AML12细胞中应用抑制剂(MCC950)药理抑制NLRP3通路后，在PSNPs刺激下ROS产生类似地减少(图6F)。这些结果表明ROS-NLRP3轴对PSNP诱导的肝脏炎症具有调节作用。

Fig. 7. PSNPs-induced NET formation drives ROS through NLRP3.

进一步研究ROS-NLRP3轴在PSNP诱导的NET形成中的作用，发现在PSNP暴露后，在与PBNs共培养的AML12细胞中，通过基因和药物抑制NLRP3后，DCFH-DA深染的细胞比例明显低于未抑制NLRP3的AML12细胞(图7A)。此外，抑制NLRP3后，暴露于DNase I-PSNPs的AML12细胞与PBNs共培养12 h, DCFH-DA的荧光强度下降到接近对照AML12细胞的荧光强度(图7A)。在另一个PBNs和AML12共培养系统中，我们首先用PSNPs或DNase I-PSNPs刺激PBNs，然后与AML12细胞共培养，无论是否有NLRP3的遗传或药理抑制作用。结果表明，抑制NLRP3可以缓解PSNP暴露引起的ROS的产生。DNase I-PSNPs刺激的PBNs几乎不会导致AML12产生ROS，而其NLRP3被抑制(图7B)。这些数据表明，PSNP暴露可通过诱导ROS生成激活NLRP3通路，DNase I清除DNA-NETs可减轻ROS-NLRP3轴的激活。

为了确定PSNP暴露诱导ROS-NLRP3轴pro-NET形成的作用，我们使用SYTOX Green对共培养体系中的DNA进行染色，发现PSNPs刺激下的AML12可以显著诱导PBNs中NETs的形成，而在PSNPs暴露后，AML12抑制NLRP3(遗传上通过转染siNLRP3，药理上通过应用MCC950的pro-NET形成的作用(图7C)。在DNase -PSNPs和抑制NLRP3的双重作用下，处理后的AML12不能诱导NET的形成(图7D)，这清楚地说明了抑制NLRP3途径可以通过减少ROS的产生而削弱PSNPs诱导NET形成的能力，反过来，应用DNase - I清除DNA-NETs可以降低ROS-NLRP3轴的激活。

此外，我们通过qPCR检测了炎症因子(TNF-α和IL-6)在AML12细胞和PBNs的CMs中的表达，与(NC-)AML12 +PS+ PBNs的CMs相比，TNF-α和IL-6在siNLRP3-AML12 +PS+ PBNs或MCC950 +AML12 +DNase I-PS+ PBNs的CMs中表达明显降低，在siNLRP3-AML12 +PS+ PBNs或MCC950 +AML12 +DNase I-PS+ PBNs的CMs中表达下降更明显(图7E-F)。PSNP诱导下PBNs形成的NETs可增加PBNs+PS+NC-AML12的CMs中TNF-α和IL-6的表达，而PBNs+PS+siNLRP3-AML12或PBNs+PS+MCC950 +AML12的CMs中TNF-α和IL-6的表达显著降低，PBNs+DNase I-PS+siNLRP3- AML12或PBNs+DNase I-PS+MCC950 +AML12的CMs中TNF-α和IL-6的表达下降更明显(图7G-H)。这些数据进一步支持了ROS-NLRP3轴对体外培养的AML12细胞中PSNP诱导的NET形成至关重要的结论。

鸣谢：Qianru Chi, et al. J Hazard Mater. 2022 Oct 5;439:129502.