AbMole科研-TIPE2可能靶向Nrf2/HO-1通路抑制哮喘中M1巨噬细胞相关的中性粒细胞炎症

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: TIPE2可能靶向Nrf2/HO-1通路抑制哮喘中M1巨噬细胞相关的中性粒细胞炎症。

目的:尽管最近的研究强调了TIPE2与哮喘气道炎症的关系，但它在不同哮喘炎症表型中的作用和分子机制仍不清楚。我们评估痰中TIPE2的表达水平及其与不同哮喘表型的相关性。此外，我们还探讨了TIPE2在巨噬细胞M1极化中的作用和机制。方法:共纳入102例接受痰诱导的哮喘患者，评估TIPE2的表达水平及其与不同哮喘表型的关系。为了探讨TIPE2在巨噬细胞M1极化中的作用和机制，以Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)刺激THP-1单核细胞作为未分化M0巨噬细胞模型，用脂多糖处理M0巨噬细胞诱导M1巨噬细胞。结果:与少粒细胞性哮喘患者相比，中性粒细胞性哮喘(NA)患者痰液TIPE2水平明显降低，嗜酸性哮喘(EA)患者痰液TIPE2水平明显升高。与其他组相比，NA组IL-1b、TNF-α和IL-6水平最高。痰中TIPE2水平与IL-1β、TNF-α水平呈负相关，与IL-4、IL-5、IL-13、IL-10水平呈正相关(P < 0.05)。在体外，TIPE2增强巨噬细胞Nrf2/HO-1通路的激活，抑制LPS诱导的M1巨噬细胞分化和相关细胞因子的释放。进一步的分析表明，Nrf2抑制剂ML385削弱了TIPE2诱导的Nrf2/ HO-1通路的激活，以及TIPE2诱导的巨噬细胞M1极化和炎症细胞因子分泌的抑制。结论:TIPE2表达水平在NA中高度下调，且与炎症因子(IL-1β、TNF-α)呈负相关。TIPE2异常表达可能靶向Nrf2/HO-1通路，抑制哮喘中M1巨噬细胞相关的中性粒细胞炎症。

Phorbol 12-myristate 13-acetate（Abmole，M4647，纯度>98%）是一种佛波酯激活的蛋白激酶C (PKC)，提高细胞内 Ca2+ 浓度 ([Ca2+]i)，EC50 为 11.7 nM，这种作用具有剂量依赖性。

FIGURE 3 | Morphological changes of THP-1 induced by PMA and LPS.

为了探讨TIPE2在巨噬细胞M1极化中的作用，以PMA刺激的THP-1单核细胞作为未分化M0巨噬细胞模型。然后用LPS处理M0巨噬细胞诱导M1巨噬细胞。M0和M1巨噬细胞在光学显微镜下初步通过形态学鉴定(图3)。

FIGURE 4 | Identification of M1 macrophages by flow cytometry.

流式细胞术进一步分析显示，PMA刺激THP-1后，CD11b+细胞显著增加(7.9% vs. 92%)(图4)。LPS继续刺激M0后，CD80+细胞显著增加(13.2% vs. 72.9%)，而CD11b+细胞数量无显著变化(92% vs. 9.1%)(图4)。这些结果支持THP-1细胞从M0和M1巨噬细胞分化。

FIGURE 5 | TIPE2 impeded M1 macrophage differentiation and inhibited the expression and release of related inflflammatory cytokines.

M1巨噬细胞和M1细胞因子(IL-6, IL-1β和TNF-α)参与哮喘中性粒细胞性气道炎症。我们的结果显示，与M0巨噬细胞相比，M1巨噬细胞中TIPE2 mRNA和蛋白表达降低(图5A, B)。然后，THP-1单核细胞与表达TIPE2 shRNA的慢病毒转导，带有TIPE2 shRNA的单核细胞显示TIPE2表达水平降低(图5B)。LPS处理后，用RT-qPCR和ELISA检测M0巨噬细胞中M1基因和细胞因子的表达水平。在M1巨噬细胞诱导条件下，与对照巨噬细胞相比，TIPE2沉默的巨噬细胞M1基因CD11c和诱导型一氧化氮合酶表达水平增加(图5C)。在TIPE2沉默的M1巨噬细胞中，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达也显著上调(图5C)。此外，与对照M1巨噬细胞相比，TIPE2基因沉默的M1巨噬细胞向上清中分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α明显增多(图5E)。然后用慢病毒在巨噬细胞中过表达TIPE2(图5B)。与对照组相比，巨噬细胞中过表达TIPE2抑制了M1基因表达和炎症细胞因子分泌(图5D, E)。TIPE2抑制LPS诱导的M1巨噬细胞分化和早期炎症。

FIGURE 6 | TIPE2 promotes Nrf2/HO-1 signaling pathway activation.

激活Nrf2/HO-1途径可以抑制巨噬细胞的M1极化并发挥抗炎作用。接下来，我们探索了TIPE2是否调节Nrf2/HO-1通路的激活。用PMA (20 ng/ml)处理48 h, LPS(1µg/ml)处理24 h后，通过RT-qPCR检测THP-1单核细胞Nrf2和HO-1蛋白的表达。结果表明，TIPE2过表达的巨噬细胞在LPS刺激后Nrf2和HO-1 mRNA表达显著增加(图6B)。用PMA (20 ng/ml)处理48 h, LPS(1µg/ml)处理24 h后，通过western blotting分析检测THP-1单核细胞Nrf2和HO-1蛋白的表达。结果发现，在过表达TIPE2的巨噬细胞中，相对Nrf2和HO-1蛋白水平也显著升高(图6D)。此外，TPE2过表达诱导M1巨噬细胞核Nrf2蛋白水平显著升高(图6E)。免疫细胞化学分析显示，过表达TIPE2的M1巨噬细胞Nrf2染色较多，尤其是核Nrf2染色较多(图6F)。然而，沉默TIPE2导致LPS诱导得 M1巨噬细胞中Nrf2, HO-1和核Nrf2的表达水平降低(图6A, C, E, F)。这些数据表明TIPE2增强了M1极化中Nrf2/HO-1通路的激活。

鸣谢：Bingqing Shi, et al. Front Immunol. 2022 Apr 28;13:883885.