AbMole科研-翻译DNA合成介导小细胞肺癌对olaparib加temozolomide的获得性耐药

AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: 翻译DNA合成介导小细胞肺癌对olaparib加temozolomide的获得性耐药。

在小细胞肺癌(SCLC)中，由于很少进行重新活检，对DNA损伤治疗的获得性耐药研究具有挑战性。我们使用患者来源的异种移植模型，在治疗前和进展后建立，来解剖对olaparib加temozolomide (OT)的获得性耐药，这是一种有希望的复发SCLC的实验性疗法。这些系列模型揭示了细胞周期动力学和DNA复制的改变，并证明了肿瘤间和肿瘤内耐药性机制的异质性。在一个模型对中，上调翻译DNA合成(TLS)使得在DNA复制过程中能够耐受OT诱导的损伤。TLS抑制剂在体外和体内都恢复了对OT的敏感性，在其他SCLC细胞系中也发现了类似的协同效应。这是首次描述对SCLC患者获得性对DNA损伤产生耐药性的机制，并强调了一系列模型方法在研究和克服对SCLC患者治疗的耐药性方面的潜力。

AZD2281 (Olaparib)（Abmole，M1664，纯度>99%）是一种选择性的PARP1/2抑制剂，IC50为5 nM/1 nM，比对Tankyrase-1的作用强300倍。Temozolomide (TMZ)（Abmole，M2129，纯度>99%）是一种DNA损伤诱导剂，修饰DNA环上的氮原子以及环外氧基团。

Fig. 2. PDXres 1518-3 cells acquire fewer DNA double-strand breaks after OT treatment.

我们首先探究对Olaparib或TMZ的已知耐药介质是否可以解释系列模型中的获得性OT耐药。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)逆转TMZ介导的鸟嘌呤残基烷基化，从而产生耐药性，事实上，启动子甲基化沉默MGMT可作为TMZ在胶质母细胞瘤中的疗效的临床生物标志物。多药耐药蛋白1 (MDR1)在胶质母细胞瘤中也可通过药物外排产生TMZ耐药。Schlafen家族成员11 (SLFN11)不可逆地使应激复制叉失活，并可能沉默以诱导SCLC对化疗和PARP抑制剂的耐药。MGMT和MDR1在两组序列模型中都没有表达，而SLFN11在所有四种模型中都有表达，并且在PDXres 1518-3复发后增加。

药物诱导的细胞死亡需要靶点结合，通过预防Olaparib、TMZ或其组合作用于细胞内分子靶点可获得耐药性。药效学失效有许多可能的途径，如PARP1复合物的改变或药物外排泵的上调，但所有这些都将减少DNA损伤的初始积累。我们从新鲜解剖的异种移植物中产生短期培养，在体外用OT处理，并测量总蛋白PARylation和DNA损伤诱导的变化。在四种模型的短期培养中，Olaparib将PARylation降低到相似的水平(图2A)。为了测量OT对DNA损伤的初始诱导，彗星测定在碱性条件下进行了相同的短期培养。OT处理的PDX细胞尾矩呈剂量依赖性和可重复性增加，PDXsens 1518-1和PDXres 1518-3之间无明显差异(图2B)。这些结果表明，在获得性抗OT后，Olaparib抑制PARylation或TMZ产生DNA损伤的能力没有显著差异。

在碱性条件下进行的彗星测定可以检测到多种形式的DNA损伤，包括双链和单链DNA断裂(DSBs和SSBs)，而在中性条件下进行的测定对DSBs更有特异性(35)。对于PDXsens 1518-1，中性彗星尾矩和碱性彗星尾矩没有差异，有趣的是，在从PDXres 1518-3分离的OT处理细胞中，中性彗星测定未能检测到破碎的DNA片段(图2C)，尽管它们在碱性测定中存在(图2B)。这种区别似乎是OT特异性的，因为在γ辐照后中性和碱性检测结果之间没有差异。在两种MGH1518模型中，OT诱导SSBs，但彗星分析表明PDXres 1518-3不再将OT诱导的SSBs转化为DSBs。

在响应DSBs和DNA复制应激时，组蛋白变体H2AX被磷脂酰肌醇3激酶相关激酶磷酸化。当DSBs形成或复制叉坍塌时，磷酸化H2AX (γH2AX)的离散核焦点很容易被检测到。因此，γH2AX焦点的水平提供了跟踪DSBs的形成和修复的间接手段。我们在体内对PDXsens 1518-1和PDXres 1518-3进行每日OT治疗，持续时间增加(1、3或5天)，切除肿瘤后最后的剂量，发现γH2AX病灶肿瘤免疫荧光的固定部分(图2 D和E),和量化细胞的百分比超过四个焦点和焦点的数量每个细胞(图2F和G)，通过指标有显著减少γH2AX PDXres 1518-3的疫源地比PDXsens 1518-1在所有时间点,提示在这些肿瘤中γH2AX灶形成减少。总之，这些结果表明，在两种模型中，OT烷基化DNA并抑制蛋白质PARylation诱导SSBs，但在PDXres 1518-3中，获得性抗性机制阻止DSBs和γH2AX焦点的积累。

Fig. 4. PDXres 1518-3 cells accumulate less DNA damage and continue to replicate DNA during OT treatment.

为了验证细胞周期分布有助于获得性抗OT的假设，测量了敏感和耐药模型中不同阶段细胞对DNA损伤的敏感性。单剂量奥拉帕尼和TMZ在体内给药PDXsens 1518-1和PDXres 1518-3，治疗后4小时或24小时切除肿瘤，以揭示OT的直接和延迟细胞效应。治疗结束后，切除前2小时腹腔注射BrdU以标记s期细胞(图4A)。同时免疫荧光检测BrdU、GEMININ和γH2AX，揭示OT是否在G0-G1、S期或G2-M期(分别为BrdU−GEMININ−、BrdU+ GEMININ+或BrdU−GEMININ+)细胞中引起dsb(γH2AX+)(图S3)。在PDXsens 1518-1中，在OT后4小时，分裂的各个阶段细胞中都存在γH2AX病灶(图4B，左)。相比之下，在PDXres 1518-3中，几乎所有的DNA损伤都集中在S期群体中，γH2AX在G1-G0或G2-M细胞中积累很少(图4B，右)。在治疗后24小时，可以观察到OT对细胞周期分布的影响。在PDXsens 1518-1中，GEMININ+细胞中BrdU掺入明显减少，提示受损细胞要么在G2中积累，要么未能完成DNA复制。相比之下，除了S期细胞增加外，PDXres 1518-3的细胞周期分布基本不受OT的影响(图4C)。这种OT对细胞周期分布的差异效应在每日给药的较长时间内被放大。在PDXsens 1518-1中，每细胞Ki-67中位强度随每日OT逐渐降低，治疗5天后，几乎所有肿瘤细胞无增殖。相反，在PDXres 1518-3中，Ki-67强度在治疗1天后基本不受影响，在治疗3天和5天后升高(图D和E)。这些结果表明G0或G1中的PDXres 1518-3细胞对OT具有耐药性，并能促进肿瘤在治疗期间和治疗后生长。

Fig. 7. TLS inhibitor synergizes with OT and induces cell death in PDXres 1518-3 SCLC cells.

测试了TLS抑制SCLC模型对OT的再敏性。TLS抑制使PDXres 1518-3细胞在体外对OT增敏(图7A)，但没有使PDXres 1528-2细胞增敏(图7B)，这与我们的假设一致，即PDXres 1528-2的获得性耐药是由另一种机制引起的。此外，JH-RE-06，一种结构独特且独立描述的TLS抑制剂，通过结合REV7相互作用表面靶向REV1，从而抑制不同的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，也使PDXres 1518-3对OT敏化。我们进一步在27个SCLC患者的细胞系中测试了OT + TLSpp组合，并将其与已知对TLS活性抑制不敏感的骨肉瘤细胞系U2OS进行了比较。而U2OS细胞的OT敏感性不因抑制TLS而改变，SBC-5、COLO-668、NCI-H82、NCI-H2029、SW1271、DMS53、NCI-H526和NCI-H841细胞株对OT + TLSpp组合的敏感性明显高于单独对OT的敏感性(图7C、D)。在NCI-H2029和DMS53中，这种协同作用在多种药物浓度下都很明显。

TLSpp在其他SCLC细胞系中似乎没有协同作用。然而，在一些细胞系中观察到的对TLSpp单独的体外敏感性(图7C)阻止了对更高TLSpp浓度的评估。TLSpp的这些作用需要REV1;TLSpp增加SW1271 SCLC细胞株对OT敏感性的能力被REV1敲低所抑制。与非NE亚型SCLC系相比，被分类为NE亚型的SCLC系对单独使用TLSpp治疗明显更敏感。然而，NE亚型与对OT + TLSpp组合的敏感性无关。此外，我们发现细胞系对OT + TLSpp组合的敏感性与对OT的敏感性呈负相关。可能是体内额外的SCLC肿瘤细胞和患者对OT + TLSpp组合高度敏感。因此，我们在体内测试了TLSpp与PDXres 1518-3的结合，同时或不同时OT。本实验结果证实TLSpp增加了PDXres 1518-3肿瘤对OT的敏感性。TLSpp作为单药治疗时只有很小的效果(图7E和F)，但导致肿瘤明显缩小，并在药物治疗结束后延长复发时间。我们还发现，在来自耐药患者1512-1A的第二个PDX模型中，TLSpp增加了对OT的体外和体内敏感性。总之，这些结果强烈表明，SCLC对OT的耐药性可以通过TLS的上调和/或过度激活获得，在某些情况下，对OT的敏感性可以通过添加TLS抑制剂部分恢复。我们发现，OT + TLSpp治疗后复发的PDXres1518-3肿瘤对联合用药仍然敏感。这表明PDXres 1518-3肿瘤在第一个周期后的再生长可能是由于细胞不完全死亡，而不是获得对TLSpp的化疗耐药。这表明有可能进一步提高这种新型TLSpp制剂的体内效率。

鸣谢：Marcello Stanzione, et al. Sci Adv. 2022 May 13;8(19):eabn1229.